Il trattamento secondario rimuove il materiale organico solubile, i nutrienti come l'azoto e il fosforo e la maggior parte dei solidi sospesi che sono sfuggiti al trattamento primario. Più frequentemente, nei processi biologici vengono utilizzati dei batteri che metabolizzano i composti organici e nei nutrienti per farli crescere e riprodursi. I due processi di trattamento biologico secondario più comuni sono i sistemi a crescita biomassa adesa e a crescita biomassa sospesa. Un processo a crescita biomassa sospesa favorisce la crescita di fiocchi di microorganismi sospesi da singoli organismi già presenti nelle acque reflue e nel riciclo dei fanghi attivi. I fiocchi contengono organismi in grado di rimuovere gli inquinanti da ambienti aerobici, anossici e anaerobici. Una volta rimossi gli inquinanti, i fiocchi vengono inviati in un processo di chiarificazione secondario in cui vengono separati dall'acqua attraverso la gravità. Una parte dei fanghi sul fondo del chiarificatore secondario viene quindi riconvogliata a monte per essere miscelata con l'effluente primario (riciclo dei fanghi attivi) per creare una miscela liquida. La parte residua dei fanghi viene rimossa dal processo (fanghi attivi reflui) per creare l'ecologia ideale dei microorganismi. I sistemi a crescita biomassa adesa si appoggiano ai microorganismi per aderire a un terreno e creare un biofilm. Le acque di fogna depositate vengono miscelate o spruzzate sul terreno rivestito dal biofilm dove i microorganismi rimuovono gli inquinanti. Come nel processo a crescita sospesa, i frammenti di biofilm e i fiocchi sospesi vengono inviati in un chiarificatore secondario per consentirne la separazione, dove i fanghi vengono riciclati e scartati e l'acqua pulita viene scaricata al processo successivo.
Affinché il trattamento biologico funzioni in modo efficiente, gli organismi necessitano di un rapporto bilanciato di nutrienti che includono il carbonio, l'azoto e il fosforo (denominato C:N:P), così come di oligoelementi che includono ferro, rame, zinco, nichel, manganese, potassio, zolfo e altri componenti solitamente presenti nelle acque reflue. Il rapporto di C:N:P comunemente accettato è 100:5:1, anche se alcuni impianti funzionano perfettamente al di fuori di questo rapporto, mentre altri sperimentano la formazione di fanghi di polisaccaridi o la crescita di batteri filamentosi che inibiscono la biologia e la sedimentazione nel chiarificatore secondario.
Per completare il trattamento secondario è possibile impiegare processi biologici multipli che includono i bacini di aerazione a flusso continuo, le vasche di aerazione a miscelazione completa, i reattori sequenziali discontinui, le vasche di ossidazione, i filtri percolatori, i reattori biologici a letto mobile, i fanghi attivi su film fissi integrati e altri ancora.
La rimozione dei nutrienti biologici (BNR, Biological Nutrient Removal) altera l'ambiente dei microorganismi per rimuovere l'azoto e il fosforo dall'acqua. Un processo BNR consiste in una fase anaerobica (assenza di ossigeno o nitrato), una anossica (assenza di ossigeno, presenza di nitrato) e una anaerobica (presenza di ossigeno), durante le quali l'acqua viene trasferita attraverso una serie di camere per svolgere diverse funzioni biologiche.
Possono essere utilizzati anche i processi di trattamento chimico, come la rimozione chimica di fosforo. Introducendo un precipitante chimico all'interno di chiarificatori e bacini di aerazione, il fosforo viene rimosso mediante flocculazione, legandosi a composti insolubili che si sedimentano e che ne consentono la rimozione sotto forma di fanghi.